提取植物组织中总RNA是对植物分子生物学方面进行研究的必要手段。高质量的总RNA可进行RT-PCR、Northern杂交分析、基因克隆、cDNA文库的建立以及转录组测序等后续试验。植物组织中所含有的RNase、多糖、未知的次级代谢物、酚类化合物以及蛋白在细胞破碎前互不影响，在破碎后则与RNA相互作用导致RNA降解、丢失或抑制后续酶促反应(李宏和王新力, 1999)。不同植物组织中的蛋白质、多糖、酚类和脂类等成分的含量有较大差异(张洋等, 2010)，因此从不同材料中提取总RNA难度不同，适宜的总RNA提取方法也不尽相同。

大豆叶片和花总RNA提取难度相对较大，相关研究报道较少。付畅等(2004)对大豆不同器官总RNA提取进行了比较，结果表明应用异硫氰酸胍法和改良异硫氰酸胍法对大豆根、茎等器官总RNA提取效果较好，但对叶片总RNA提取效果不佳。刘易科等(2006)利用改良TRIzol法用于大豆根、茎、叶及生长点总RNA的提取，取得了较好的实验效果，而改良异硫氰酸胍法则无法用于大豆叶片总RNA提取。目前针对大豆花器官总RNA提取方法还未见报道。

本研究比较了植物总RNA提取试盒剂法、改良CTAB法和改良热硼酸法对大豆叶片和花总RNA提取效果，从中筛选出适合大豆叶片和花两种器官总RNA提取最佳方法。将提取获得的总RNA应用于基因克隆及荧光定量PCR等实验，以验证该方法所提取的总RNA能否满足下游分子生物学实验，为大豆基因工程研究奠定实践基础。

1结果与分析
1.1大豆叶和花总RNA提取
采用3种方法分别对大豆叶和花器官进行总RNA提取，分别为植物总RNA提取试盒剂法、改良CTAB法和改良热硼酸法。结果表明：3种方法均可提取出大豆叶和花总RNA，但提取总RNA的含量不同。其中改良热硼酸法提取的总RNA含量最高(表1)，叶片中总RNA含量为869.5 μg/g，花中总RNA含量为124.16 μg/g，该方法所获得的总RNA含量约为其他两种方法的6倍。3种方法提取的总RNA在OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.98~2.1之间，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值在0.12~2.37之间。尽管植物总RNA提取试剂盒法所提取的总RNA的18S、28S rRNA条带清楚，但含量较低且有DNA残留(图1A)。改良CTAB-LiCl法提取的总RNA出现拖尾情况，不能够清晰的分辨出18S、28S rRNA条带，所得总RNA完整性较差，有明显的降解(图1B)。改良热硼酸法所提取总RNA无拖尾现象，且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍(图1C)。

表1 不同方法提取大豆两器官总RNA的含量及质量 Table 1 Quality and concentration analysis of extracted total RNA from leaves and flowers in soybean

图1 两种器官提取总RNA电泳结果 Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA extracted from leaves and flowers in soybean

1.2 GmZAT9-like基因克隆及分析
为确定改良热硼酸法提取大豆叶、花两种器官的总RNA能否满足下游分子生物学实验。以该法提取总RNA反转录的cDNA为模板，RT-PCR扩增GmZAT9-like基因片段，结果成功扩增出约1 kb左右的特异片段(图2)。经测序，获得885 bp的核酸序列，与NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中所登录的Glycine max zinc finger protein ZAT9-like (登录号: XM_003517371.1)基因核酸序列同源性达99% (表2)，序列比对结果表明该基因在第158碱基处有一个位点发生变异(T→C) (图3)。

图2 GmZAT9-like基因的克隆 Figure 2 The results of GmZAT9-like gene cloning

表2 GmZAT9-like基因序列BLAST比对结果 Table 2 The BLASTn results of GmZAT9-like gene sequence

图3 GmZAT9-like基因序列比对结果 Figure 3 The BLASTn results of GmZAT9-like gene sequence

1.3 H3基因实时荧光定量PCR分析
实时荧光定量PCR技术对总RNA的纯度有很高的要求，为进一步确认所提取的总RNA的质量，我们利用实时荧光定量PCR对H 3基因进行了表达分析。结果表明：基因扩增的融解曲线图(图4)，出现了一个明显的峰值，同时扩增曲线具有明显的3个阶段，说明该荧光定量PCR实验所用引物、体系以及模板合适。

图4 实时荧光定量PCR检测Histone 3基因的融解曲线及扩增曲线 Figure 4 The melting and amplification curves of Histone 3 gene were detected by real time PCR

2讨论
大豆叶中富含大量多糖、蛋白和酚类化合物，花中含有大量色素类物质。这些杂质及其它次级代谢物等，严重干扰大豆叶及花总RNA提取(Louime et al., 2008)。由于这些物质与RNA共沉后形成难溶物，很难从总RNA中再次分离出来，降低了总RNA在水中溶解度；不溶物或杂质干扰RNA的紫外吸收值，并可抑制后续的各种酶促反应(夏海武等, 2006; Schneiderbauer et al., 1991)。因此有效去除多糖、蛋白和酚类化合物及干扰RNA提取的其它代谢产物就能够提高对大豆叶、花总RNA的提取质量。

植物总RNA提取试剂盒法，具有操作简单、提取时间短的优点。但针对本研究中大豆叶和花的总RNA提取效果不理想，可能原因为试剂盒中的提取液对大豆叶片和花的组织裂解不够彻底，没有有效的去除多糖、蛋白和酚类化合物，从而导致了总RNA的得率降低。且在纯化柱上消化DNA时不够彻底，导致DNA的残留，因此无法进行后续的分子生物学实验。而改良CTAB法中前期加入β-巯基乙醇，可有效的改善酚类物质的氧化，降低对RNA提取的干扰。但此法需要高温振荡下辅助裂解，高温使总RNA不稳定，出现轻微降解现象(任杰等, 2011)。改良热硼酸法相对属于一种温和的裂解方法，且在使用DTT和蛋白酶K后能够有效地抑制多糖、酚类以及其他影响RNA的次级代谢产物，将大豆叶和花的细胞内含物对总RNA提取影响降到最低。

由于大豆为油料作物，其叶和花中不但含有色素类物质，同时还有大量的油脂蛋白。针对材料的特殊性，利用改良热硼酸法的温和裂解特性，保证了总RNA的产量。且通过两次氯仿抽提，将叶绿素、花青素等色素类物质去除，同时氯仿进一步降低了蛋白的含量，减少蛋白及色素类物质对RNA的干扰，提高了总RNA的质量。

总之，与前两种提取大豆叶和花的总RNA方法相比，改良热硼酸法能够在保证产量及质量的同时，提高效率和降低成本，并能够满足RT-PCR、基因克隆及Real time RT-PCR等分子生物学实验的要求。这种提取方法及应用为大豆基因工程研究奠定了技术基础。

3材料和方法
3.1材料及试剂
实验材料为栽培大豆品种‘晋大74’(产地: 山西)，由山西农业大学农学院李贵全老师惠赠。2012年5月，种植于山西农业大学农作站试验田。大豆盛花期时，取顶端幼嫩叶片和花器官，经液氮速冻后置于-70℃的超低温冰箱中保存备用。所有无RNase试剂均购置于北京天恩泽公司。离心管等用品使用0.1%DEPC水处理并高温灭菌。

3.2大豆叶片总RNA 提取方法
3.2.1试剂盒法提取植物总RNA
采用康为世纪公司生产的植物RNA提取试剂盒(Cat. No: CW0559)，具体详细操作步骤请参见该产品说明书。

3.2.2改良CTAB法提取植物总RNA
提取液成分：2% CTAB(W/V)，4 PVP(W/V)，100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)，25 mmol/L EDTA (pH 8.0)，2 mol/L NaC1混匀灭菌120℃，15 min (胡根海和喻树迅, 2007)。

(1)称取100 mg的叶片组织，迅速放人液氮研磨呈粉末状，转入2 mL离心管内，加入预热65℃的提取液700 μL和300 μL的β-巯基乙醇，65℃温浴并震荡20 min。

(2)加入等体积的氯仿：异丙醇(24:1)混匀，4℃，10 000 r/min离心10 min。

(3)吸上清装入新的离心管里，加入1/4体积的10 mol/L LiCl混匀后，4℃冰箱过夜沉淀。

(4) 4℃，12 000 r/min离心10 min倒掉上清液沉淀晾干，加入100 μL无RNA酶水溶解。

(5)加入无RNase的DNaseⅠ于37℃恒温培养箱中消化RNA 30 min。

(6)加入等体积的氯仿抽提一次，4℃，13 000 r/min离心10 min。

(7)取适量上清液，-70℃超低温冰箱保存或直接进行后续试验。

3.2.3改良热硼酸法
提取液成分：200 mmol/L Na₂B₄O₇•10H₂O，25 mmol/L EDTA，1% (W/V)SDS，1% (W/V)脱氧胆酸钠，2% (W/V)PVP(MW 40 000)，0.5% Nonidet-40 (NP-40, PH 9.0)。

(1)将0.1 g叶片组织放入预冷的研钵中，液氮研磨，将粉状的组织放入DEPC预处理过的1.5 mL离心管中，加入1 mL预热至80℃的基本提取液，同时加入10 μL DTT (亚精胺, 1 mol/L)贮备液和40 μL蛋白酶K (20 mg/ml)贮备液。

(2)放置于42℃摇床中100 r/min温和混匀1.5 h。将混匀后的离心管中加入80 μL KCl (2 mol)，冰上放置1 h。

(3) 12 000 r/min离心20 min，取900 μL上清液，尽量取上清，可以减少体积，加入1/3上清体积的10 mol/L LiCl，将离心管上下颠倒几次，放置于4℃冰箱过夜(至少8 h)。

(4) 12 000 r/min离心20 min，弃掉上清，沉淀用2 mol/L LiCl (4℃预冷)洗2~3次，直到上清液为无色。

(5)加入400 μL的10 mmol/L Tris-HCl (PH 7.5)悬浮沉淀，将沉淀完全溶解，加入等体积的氯仿，混匀后12 000 r/min离心10 min，将上清液转移到另外一只新的离心管中。

(6)加入1/10体积的2 mol/L KAC (PH 5.5)，颠倒混匀，放置于冰上，冷却至0℃。

(7) 15 000 r/min 离心10 min，转移300 μL上清液，注意不要吸上管底杂质。

(8)加入750 μL冰冷的无水乙醇，–70℃冷冻1 h。15 000 r/min离心10 min。

(9)用70%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，再加入无水乙醇洗涤RNA沉淀，12 000 r/min离心5 min后，弃掉液体。

(10)放置于超净台中自然风干5 min，用无RNA酶水溶解RNA沉淀。

(11)加入无RNase的DNaseⅠ于37℃恒温培养箱中消化RNA 30 min。

(12)加入等体积的氯仿，混匀后12 000 r/min离心10 min。

(13)取适量上清液，-70℃超低温冰箱保存或直接进行后续试验。

3.3大豆叶片总RNA完整性及纯度检测
RNA完整性采用1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测(上样量为5 μL)，紫外凝胶成像系统观察并拍照；纯度及含量则采用e-spect蛋白核酸分析仪检测(上样量为1.5 μL) (肖旭峰等, 2011)

3.4基因克隆
以质量较好的大豆叶片和花总RNA为模板，使用Prime Script® RT Master Mix (TaKaRa, Code: DRR036S)试剂盒反转录成cDNA第一链。根据NCBI数据库中已报道的大豆GmZAT9-like (GenBank登录号: XM_003517371)基因序列设计特异引物(上游引物序列: ATGGAGCGGTACAAATGCA; 下游引物序列: AGTAATTATCAGGCATCAGAAAC)，RT-PCR反应体系建立：1 μL cDNA为模板，2 μL 10×Ex Taq Buffer (Mg²⁺ Plus)，1.6 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，补足纯水至总体积20 μL。特异目的条带经切胶回收纯化后，克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆送上海生工生物公司测序。

3.5 Real-time PCR检测内参基因表达
用Stratagene公司的Mx3000P荧光定量PCR仪对Histone 3基因(GenBank登录号: U38425.1)进行实时荧光定量PCR分析。上游引物序列：CAGACTGATCTGCGTTTCCA；下游引物序列：GTCCTCAAAGAGCCCAACAA。UltraSYBR Mixture检测试剂购置于北京康为世纪生物科技有限公司(CW0956A)。反应体系包括：10 μmol/L上、下游引物各0.25 μL，2 μL cDNA，10 μL UltraSYBR Mixture (2×)和7.5 μL超纯水。反应条件为：95℃ 10 min (1个循环)；95℃ 15 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s (40个循环)。

作者贡献
郭彬和侯思宇是本研究的实验设计、实验研究和论文初稿的写作执行人，在本文中同等贡献，为共同第一作者；路阳及黄可盛完成数据分析；韩渊怀负责文章摘要部分的英文编辑；通讯作者王玉国是项目的构思者及负责人。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由山西省青年科技研究基金(2011021032-3)、山西省青年科技研究基金(2011021032-1)、山西农业大学创新基金(2010028)和山西省科技攻关项目(20120311005-3)共同资助。

参考文献
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